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但有些事实却似乎否定了上述的设想。牡蛎随天气变化而改变其性别，家蚕能根据外界环境条件而改变后代中雌雄的比例。蚯蚓任何时候都是雌雄同体，各种雌雄嵌合体也都既是雌虫，又是雄虫。在英格兰的研究表明，雌蛾和雌鸟是异配子性，也就是说，它们有一条X染色体和一条Y染色体，而不是一对X染色体。但美国的研究（主要以昆虫为研究对象）却表明雄性是异配子性，即XY。使这一问题进一步复杂化而更加今人不解的是。有一种同翅类昆虫，它们分为英国类型和美国类型，英国类型的未受精卵产生雄性后代，美国类型的未受精卵却产生雌性后代。

当科学界证明了存在天然的或人工的孤雌生殖后，认为精子携带X或Y染色体从而决定性别这个简单概念就更加难以使人接受了。既然洛布的实验中根本没有精子参与就产生了雄蛙和雌蛙，那么，性别怎能说是由精子决定的呢？

摩尔根对性决定的机理产生了浓厚的兴趣。1903年，他著文评述了当时流行的各种理论，1906年开始搞一个七年研究计划。研究一种特别偏好葡萄的昆虫根瘤蚜是怎样得以孤雌生殖出雄蚜和雌蚜的。到1910年，研究结果似乎同染色体性决定的理论不一致。

1907年，摩尔根在《实验动物学》中讨论性决定的内在因素时，用了大量篇幅谈非染色体的决定因素。他指出，史蒂文斯对粉虫的研究和威尔逊对大长蝽的研究澄清了一些非常重要的问题。两人的研究都证明了雄性带有染色体X和Y。“但我觉得，可以作一个更简单的假设：胚胎的性别不是在卵子或精子中就已决定了的，它可能是由胚的细胞中染色质的活动产生的数量反应决定的。”他似乎对魏斯曼略持批评态度。魏氏认为有性生殖的目的在于诱发变异。摩尔根始终对目的论深恶痛绝。他说：“孤雌生殖产生的无性类型”中的变异同通过有性过程而产生的类型中的变异同样引人注目。“

卡斯尔在哈佛大学发现雌雄同体的玻璃海鞘不能自体受精。这时，摩尔根紧接着开始了自体不孕机制的研究。摩尔根写道：“我已经用海鞘和其它几种生物做过实验，希望找出自体不孕的原因。把卵子浸泡在另一个体的血液或卵巢浸提液中，就不能使生物的卵接受自身的精子；反之，把精子浸泡在另一个体的血液或睾丸浸提液中，精子就不能进入‘自身的’卵子。”他觉得这样的结果十分复杂，不好解释，但他毕生都在试图研究这一问题，临到他离开人世，仍然没有停止这种努力。

摩尔根经常让几十个实验同时进行。不出他之所料，许多实验走进了死胡同。他常自嘲说，他搞的实验共有三类，一类是愚蠢的实验，一类是蠢得要命的实验，还有一类比第二类更糟糕的实验。但是，这一时期有一个实验——关于拉马克学说的实验——却有了意想不到的收获。1908年，摩尔根让他手下一名研究生在黑暗的环境里饲养果蝇，希望产生出由于长期不用眼睛而导致眼睛萎缩、往后几代眼睛终于会消失的果蝇：费尔南达斯·佩恩从前曾研究过来自古巴的盲蜥蜴和印第安纳州的无眼盲鱼，所以摩尔根建议佩恩试搞一下类似的实验。他把香蕉放在实验室的窗台上，用以招引果蝇。果蝇这种动物是种形体很小的蝇类，在美国又曾叫做醋蝇、果渣蝇，甚至叫做香蕉蝇，因为这种昆虫是随着香蕉传入北美的。用果蝇作为实验动物这个想法是卡斯尔在哈佛大学提出来的。他有个叫伍德沃德的学生，从1900年起就在饲养这种蝇类来研究近交的效应。佩恩的研究中，虽然连续繁衍了六十九代，始终不让它们见到日光，但结果却一事无成。第六十九代羽化出来，一时睁不开眼睛，这时，佩恩忙叫摩尔根快过来看，逗着他说这次好像成功了。但这些果蝇不久便恢复常态，若无其事地向窗口飞去。

但确有意义的是，这种最理想不过的动物被引进到哥伦比亚大学摩尔根的实验室。这种动物对生儿育女既无节制，又无顾忌，而且生得又快又多。它们吃得很省——只消一点捣烂发酵的香蕉就足够了。由于果蝇躯体小，所以小小的牛奶罐里可以饲养很多很多。这间面积为27x23英尺的哥伦比亚大学实验室，沿墙壁四周摆满了牛奶罐，其中生长着千千万万的果蝇。不久，人们干脆把这实验室叫做“蝇室”。

摩尔根对果蝇进行的第二次实验也是与佩恩一起搞的，这大概是受了德弗里斯的影响。德弗里斯1904年在纽约科尔德斯普林港提出可以人工诱发突变。他说：“能穿透活细胞内部的伦琴射线和居里射线应该试用来改变生殖细胞内的遗传颗粒。”于是，摩